Diagnosis botulisme didasarkan pada identifikasi toksin Clostridium botulinum di laboratorium dan pada pengamatan gejala-gejala klinis, walaupun kadang-kadang tidak spesifik. Penyakit ini, pada kenyataannya, dapat dikacaukan dengan sindrom Guillain-Barré, poliomyelitis, stroke, myasthenia gravis dan kelumpuhan kutu.
Dalam botulisme makanan, gambaran gangguan neuromuskuler dan konsumsi makanan yang berpotensi terkontaminasi adalah petunjuk penting. Manifestasi simultan pada setidaknya 2 pasien yang makan makanan yang sama menyederhanakan diagnosis. Konfirmasi diperoleh dengan mengisolasi mikroorganisme dengan uji kultur sampel makanan atau tinja yang dicurigai pasien dan dengan identifikasi toksin botulinum dalam makanan atau bahan biologis (seperti darah, jus lambung dan muntah).
Di botulisme luka, di sisi lain, diagnosis toksin serum atau isolasi Clostridium botulinum dari sampel lesi kulit mengkonfirmasi hal ini.
